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?——【 ·前言· 】——?
脊柱后關節置換手術后的臨床愈合環境是所有骨科介入手術中最具臨床挑戰性的骨愈合環境之一，因為缺乏封閉空間卻需要形成新生骨，但在整個脊柱融合過程中，硬骨素在控制骨融合中的作用仍有待確定。
本研究中，我們將通過計算確定了兩種 FDA 批準的藥物以及一種新型小分子藥物，然后將這些藥物作為獨立的骨誘導劑在普通膠原海綿上進行皮下測試，主要為了在兔子后外側脊柱融合模型中測試頂級候選藥物（稱為 VA1 和 C07）成功實現融合的能力。
實驗最終的目的是為了通過控制 GSK3b 磷酸化，實現三種小分子抑制劑 (SMI) 可同時增強經典 Wnt 信號傳導并增強經典 BMP 信號傳導強度和持續時間。
我們認為這兩種SMI具有這種獨特的能力，并被證明可以在嚴格的體內環境中誘導新生骨，可能有潛力用于新型、具有成本效益的骨移植替代品，以實現脊柱融合或治愈臨界尺寸的骨折缺損。
硬化蛋白屬于 DAN 蛋白家族，有一個半胱氨酸結，將其間插序列分為三個環，第一個和第三個環突出到中心結的兩側，環 2 區域是功能性抗硬化素抗體的已知結合位點，突變分析表明，環 2 區域的 Leu-90 到 Asn-103 殘基的突變導致硬化素無法與 LRP5/6 結合。
同樣，環 2 區域（Asp-92 或 Ile-94）中單個氨基酸的突變已知會影響硬化素與 LRP6 的結合，具有 Cys-84 和 Cys-142 交換（導致胱氨酸結的第三個二硫鍵去除）的鼠硬化蛋白突變體降低了與 LRP5/6 的結合親和力，表明柔性環 2 區域之外的元素對于適當的硬化蛋白功能也很重要。
因此，硬化蛋白上的這兩個區域被認為為抗硬化蛋白 SMI 的開發提供了強有力的候選區域，AutoDock Vina 的虛擬篩選結果使用 PyMOL進行可視化，FRED 的虛擬篩選結果使用 Omega 進行可視化。
使用硬化蛋白 (ID 2K8P) 的可用 PDB（蛋白質數據庫）核磁共振波譜結構進行受體結構聚焦對接來分析結合模式及其估計的親和力，在該結構的 36 個構象異構體中，選擇了最具代表性的構象異構體。
骨髓基質細胞（BMSC）最初是通過離心從小鼠骨髓中分離出來的，所有細胞均在八次傳代內使用，前成骨細胞（BMSC 和 MC3T3-E1）在補充有 50 U/ml 青霉素、50 mg/ml 鏈霉素、2 mM L-谷氨酰胺（Thermo Scientific）的 α-改良 Eagle 培養基（α-MEM；Thermo Scientific）中培養，和 10% FBS。
第 4-7 代的 C2C12 細胞在 T-75 cm 中傳代培養2 個燒瓶，置于 DMEM 中，補充有 10% FBS，37°C，5% CO 2中，加濕，當燒瓶達到 60-70% 匯合時，將細胞進行胰蛋白酶消化，并以 200,000 個細胞/孔一式三份接種在 6 孔板中，用于定量實時 RT-PCR 和堿性磷酸酶 (ALP) 測定，或以 50,000 個細胞/孔接種在 12 孔板中進行雙熒光素酶報告基因測定。
Wnt 報告活性
使用 Wnt 特異性 TCF/LEF 驅動的報告質粒 (QIAGEN, Valencia, CA)第 1 天，將 C2C12 細胞用胰蛋白酶消化，并以 50,000 個細胞/孔的密度接種在 12 孔板中的一式三份孔中，第 2 天，使用 SuperFect (QIAGEN) 將細胞與報告構建體和海腎熒光素酶對照載體共轉染24 小時，
每孔共轉染質粒1μg，海腎熒光素酶載體濃度為報告質粒的1/15。
第 3 天，用含有 2% FBS 的 DMEM 替換培養基，并用 10 ng/ml 的 Wnt3a 和 ±10 μM 硬化素相互作用化合物處理細胞，第 4 天，使用雙熒光素酶測定系統（Promega，Madison，WI）和光度計（LumiCount；Packard Bioscience，Meriden，CT）。
BMP 報告活性
第 1 天，將 C2C12 細胞胰蛋白酶化，并以每孔 50,000 個細胞的數量種入 12 孔板的三聯孔中，第 2 天，使用 SuperFect (QIAGEN)將細胞與 9 × GCCG 報告基因構建體和雷尼拉熒光素酶對照載體共轉染 24 小時，每孔共轉染 1 μg 質粒，褪黑素-熒光素酶載體的濃度為 9 × GCCG 報告質粒的 1/15。
第 3 天，用含 2% FBS 的 DMEM 更換培養基，并用不同濃度的化合物處理細胞，第 4 天，用 BMP-2 處理細胞，第 5 天測量熒光素酶活性。
所有兔子都接受了單水平、雙側、后外側橫突間融合術，利用骨性地標在腰部做一個背中線皮膚切口，然后做兩個副腰筋膜切口，在多裂肌和長肌之間的肌肉間平面進行顯露，以暴露 橫突以及橫隔膜。
在需要采集 ICBG 的兔子身上，在每個髂嵴上方再做一個筋膜切口，以采集 ~1.5-2.0 毫升的皮質康采恩自體骨移植物，然后用電動毛刺對暴露的 TP 進行去骨皮質處理，將 SMI（300 或 500 mM）裝入普通膠原海綿，海綿±ICBG 放置在脊柱旁床的去骨皮質 TP 之間。
使用 3-0 可吸收線縫合筋膜切口，然后用訂書機縫合皮膚，術前皮下注射 5 毫克/千克的頭孢噻呋鈉（Naxcel）作為抗生素，并用嗎啡（0.01 微克/千克）進行硬膜外阻滯，用于摘除 ICBG 的兔子。
所有兔子的術后止痛都使用了經皮芬太尼貼片（25 微克/小時），均可自由進食和活動，受到嚴密監控進行疼痛治療，在關節置換術后 6 周，使用戊巴比妥靜脈注射對兔子實施安樂死。
組織固定后，將融合塊脫鈣并石蠟包埋，然后將連續矢狀切片脫蠟，在二甲苯中脫水，并在酒精梯度（100%、95%、75%、50%乙醇）中連續孵育，然后在蒸餾水中再水化，然后將樣品用 H&E 染色。
染色后，通過在濃度遞增的酒精梯度（50%、75%、95%、100%乙醇）中連續溫育切片進行脫水，然后在二甲苯中溫育5分鐘，向每個切片添加一滴封固劑，然后放置蓋玻片使用 Leica DM6 B 正置顯微鏡以 5 倍放大倍數對切片進行成像和合并，以獲得整個融合塊的代表性圖像。
我們通過使用小鼠 MSC 以及 MC3T3-E1 細胞評估不同時間點的C 末端磷酸化 (pSmad1 Cter )水平來研究 Smad1 信號的強度和持續時間，已知這些細胞對血清中的 BMP 反應特別好，僅添加重組人 (rh)BMP-2 (50 ng/ml) 15 分鐘，對 SMI 候選物 (0–20 μM) 重復此操作。
SB415286 (40 μM) 是一種已知的 GSK3b 抑制劑，也可用作陽性對照，我們使用 Wnt1 條件培養基測定了磷酸化-β-連環蛋白和非磷酸化-β-連環蛋白的水平，無論是否存在重組鼠硬化素（rmSCL，80 ng/ml），以及有或沒有硬化素 SMI （0、2.5、5、7.5、10、15 和 20 μM），使用小鼠 MSC 以及 MC3T3-E1 細胞作為模型系統。
根據研究方案，我們還使用了哺乳動物蛋白提取試劑（Pierce Biotechnology，Rockford，IL）裂解細胞以獲得總蛋白，或使用 NE-PER 核和細胞質提取試劑（Pierce Biotechnology）裂解細胞以獲得核蛋白，每個樣品（10 μg 蛋白質）與 NuPage 上樣緩沖液混合，總體積為 20 μl，并煮沸 5 分鐘。
在變性條件下，在 NuPage Bis-Tris Pre-Cast 凝膠（Invitrogen）上以 200 V 電泳 60 分鐘來分離蛋白質，然后轉移到硝酸纖維素膜（Invitrogen）上，以 30 V 電泳 60 分鐘，轉移后，將膜孵育在 25 ml 封閉緩沖液（Tris 緩沖鹽水 [TBS] 中的 5% 脫脂奶粉）中，室溫封閉 1 小時。
封鎖后，將膜在 15 ml 含有 0.1% Tween-20 (TBST) 的 TBS 中洗滌 3 次，每次 5 分鐘，洗過的膜與不同的一抗在 TBST 中于 4°C 孵育過夜，與一抗孵育后，用 15 ml TBST 洗膜 3 次，每次 5 分鐘。
將洗滌后的膜與所示 HRP 綴合的抗兔或抗小鼠二抗（1:2000，Cell Signaling Technology，Beverly，MA）在 10 ml 封閉緩沖液中一起孵育，并在室溫下輕輕攪拌 1 小時，與二抗孵育后，用 15 ml TBST 洗膜 3 次，每次 5 分鐘，將洗過的膜與 5 ml SuperSignal West Pico 蛋白質印跡底物 (Pierce Biotechnology) 一起在室溫下溫育 4 分鐘，并輕輕攪拌，將膜排出多余的顯影液，用保鮮膜包裹，并暴露在 X 射線膠片下。
使用經過驗證的后外側腰椎融合兔模型評估了 C07 和 VA1 在體內增強脊柱融合率的能力，兩種 SMI 都作為獨立的骨誘導藥物以及與自體 ICBG 組合使用兩種單獨的劑量（300 和 500 mM）進行了測試。
所有兔子在關節固定手術 6 周后由兩位經驗豐富的脊柱外科醫生（SBD 和 SMP）進行評估，并通過平片和 μCT 評估脊柱融合腫塊成功的融合（定義為 TP 之間的連續橋接骨），當C07以500mM的劑量與ICBG組合使用時，與單獨使用ICBG的對照相比，后外側脊柱融合率顯著增加(83%對66%，p<0.05)。
當較高劑量的 VA1 (500 mM) 與自體 ICBG 一起使用時，與單獨使用 ICBG 的對照相比，融合率也顯著增加 (80% vs. 66%，p<0.05)，當 C07 和 VA1 以 500 mM 作為獨立藥物在沒有 ICBG 的普通膠原海綿上使用時，分別有 33% 和 17% 的脊柱成功融合。
由于 C07 作為獨立的成骨藥物在實現后外側脊柱融合方面取得了特別令人鼓舞的結果，我們接下來在不使用 ICBG 的情況下以 500 和 750 mM 的劑量測試 C07 (n = 6)和以前一樣，在脊柱的兩側使用一劑，以便每只兔子充當自己的內部對照。
關節固定手術后6周，發現高劑量的C07（750 mM）在80%的兔子中產生了成功的后外側脊柱融合，這些脊柱融合床的組織學切片顯示融合塊周邊（從每個 TP 發出）有膜性骨形成，以及朝向融合塊中心的軟骨內骨形成，在單獨接受C07的那些動物和接受C07和自體ICBG的那些動物之間，沒有觀察到骨質量的顯著差異。
鑒于目前可供臨床使用的骨移植方案存在個體缺陷，再加上骨折修復或脊柱融合后發生假關節而導致的不良結果和醫療費用增加，臨床上顯然需要開發外科醫生在手術時可以使用的額外生物選擇，以便在這些困難的臨床環境中始終如一地實現骨愈合。
在抗硬化素單克隆抗體系統遞送的開創性工作的基礎上，我們發現了一種基于局部遞送硬化素 SMI 來刺激成骨的新生物策略，證明我們的硬化素 SMI 能夠在體外（BMSC 和前成骨細胞）和體內增強 Wnt/β-catenin 和經典 BMP 信號傳導，從而增加成骨作用，同時降低骨吸收活性。
盡管這些結果令人鼓舞，但這項研究的一些局限性值得一提，那就是大鼠和兔子的體內數據無法預測地轉化為更具臨床相關性的模型，我們也在積極探索這些硬化素 SMI 在臨界尺寸骨折缺陷動物模型中的用途。
另一個局限性是，我們沒有明確證實 SMI 是通過其預期的局部機制而不是通過某些未知的脫靶效應發揮其生物學作用，未來測量系統循環硬化蛋白的研究可以回答這個問題。
最終我們鑒定了幾種小分子（VA1 和 C07），它們都通過阻斷細胞外硬化素及其受體 LRP5/6 的相互作用來發揮作用，這些硬化蛋白 SMI 強烈增強局部經典 Wnt 和 BMP 信號傳導，并且它們能夠作為獨立藥物在體外和體內驅動成骨，這是蛋白質或小分子的罕見屬性。
這種成骨作用是通過 GSK3b 介導的對 Smad1 磷酸化持續時間的影響，增強 Wnt/β-catenin 信號傳導和經典 BMP 信號傳導來實現的，而硬化素 SMI 極有可能具有作為新型經濟有效的生物骨移植增強劑的潛力，或替代修復大的臨界尺寸骨折缺損或脊柱融合。
參考文獻
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近日，來自四川大學華西生物治療國家重點實驗室的魏于全院士課題組首次采用人工病毒進行CRISPR-Cas9基因編輯系統輸送，成功在小鼠腫瘤模型中完成了靶基因編輯，達到了較好的腫瘤治療效果，相關成果發表在《美國化學學會·納米》雜志上。
《自然》雜志關于四川大學華西醫院盧鈾教授首次利用CRISPR技術編輯T細胞并回輸至病人體內進行腫瘤治療的報道想必大家都看到了，驚嘆于盧鈾教授的勇氣與先見的同時，筆者發現最近華西醫院還有一項CRISPR應用研究也取得了新進展，來自華西生物治療國家重點實驗室的魏于全院士課題組首次采用人工病毒進行CRISPR-Cas9輸送，成功在小鼠腫瘤模型中完成了靶基因編輯，達到了較好的腫瘤治療效果，相關成果發表在《美國化學學會·納米》雜志上。
大家可能會說，人體實驗都已經在進行了，小鼠實驗似乎也不足為奇了吧？別忘了，人體實驗是進行免疫細胞T細胞的體外編輯，編輯完成后再回輸治療，但是功能強大的魔剪，只用在體外編輯T細胞似乎有點大材小用，直接在體內用CRISPR敲除腫瘤基因進行腫瘤治療也是研究人員夢寐以求的事情。雖然目前為止已經有不少研究用CRISPR進行腫瘤基因編輯，但是這些研究存在著不少問題，使用的方法臨床轉化也相當困難。目前研究采用的體內給藥CRISPR-Cas9質粒DNA的手段主要有三種，一種是水流動力學注射，即將約為小鼠體重10%的DNA質粒注射液通過尾靜脈在3-8秒內注射到小鼠體內（腦補一下打點滴時的情形），這會造成血壓瞬間升高，可能造成器官損傷，在人體內幾乎無法實現；另一種方式則是采用腺病毒載體進行CRISPR質粒DNA的輸送，但是腺病毒具有免疫原性，有引發免疫反應的風險，最重要的是由于CRISPR質粒DNA太大，腺病毒負載能力實在太低，因此效率不高，心有余而力不足；第三種則是局部注射質粒，其缺點不言而喻，對于人體深部疾病似乎鞭長莫及啊。
基于此，魏于全院士課題組合成了一種新型的人工病毒載體用于CRISPR-Cas9質粒DNA的輸送，他們合成了靶向乳腺癌中的MTH1基因（一個可以促使基因組穩定、阻止細胞死亡的基因，乳腺癌病人腫瘤組織高表達）的CRISPR-Cas9質粒DNA（Cas9-hMTH1）在小鼠體內進行了實驗驗證。由于質粒DNA帶負電，他們選擇了帶正電的氟原子修飾的聚乙烯亞胺（PF33）與質粒DNA混合，通過正負電荷相互作用形成人工病毒（PF33/ Cas9-hMTH1，實際上就是一種納米顆粒），同時為了增強人工病毒的輸送効率，他們采用一種多功能高分子RGD-R8-PEG-HA對人工病毒進行修飾得到了靶向MTH1的多功能核殼結構CRISPR-Cas9輸送人工病毒（RRPHC/Cas9-hMTH1），這種高分子可以使人工病毒更穩定，同時避免被免疫系統清除，RGD和HA可以同時靶向結合腫瘤部位高表達的整合素ανβ3和CD44受體，從而提高人工病毒在腫瘤部位的富集。同時，腫瘤部位高表達的透明酸質（HA）酶可以降解HA，促進Cas9-hMTH1在腫瘤中的釋放，從而增強療效。
體外細胞轉染實驗表明該人工病毒的轉染效率明顯高于商用轉染試劑SuperFect、Lipofectamine 2000及Lipofectamine 3000，表明該載體可以更有效攜帶Cas9-hMTH1進入細胞，同時雙重靶向策略可以使該人工病毒更特異性結合并進入乳腺癌細胞完成基因敲除。功能性實驗表明該人工病毒可以成功敲除MTH1，導致癌細胞凋亡，顯著抑制乳腺癌細胞增殖。通過小鼠尾靜脈注射人工病毒（僅含5 微克 Cas9-hMTH1，而文獻報道水動力學注射需要100 微克左右）后，可發現小鼠腫瘤組織有較多的人工病毒富集，免疫組化分析也顯示腫瘤部位MTH1蛋白表達量顯著降低，同時小鼠腫瘤生長及轉移也得到了明顯的抑制。最后他們對人工病毒的安全性進行了評價，血細胞計數發現注射人工病毒對血細胞數量無明顯影響，基因測序顯示正常組織中的突變率均低于0.4%，且都不是插入或者缺失突變，僅為單堿基替換突變。
雖然他們認為該人工病毒具有較好的安全性，可以用于腫瘤特定基因的敲除進行腫瘤治療，但是筆者認為0.4%的突變率是不是還是有點高呢，有沒有辦法再優化一下繼續降低脫靶率呢？據報道，他們下一步的研究計劃是使用這種人工病毒輸送其他CRISPR-Cas9質粒DNA及功能化的DNA結合蛋白用于拓展該人工病毒的應用范圍。
參考文獻：
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsnano.6b04261