流式細胞術（Flow , FCM），顧名思義是一種研究細胞的技術，即利用流式細胞儀通過檢測標記的熒光信號，對處在穩定、快速、直線流動狀態中的顆粒性物質進行逐個、多參數的定性、定量分析或分選的技術。
研究對象：顆粒性物質，如大量的臨床樣本、外周血、骨髓、細胞穿刺液、洗脫液以及各種培養細胞、藻類、原生動物、病毒等生物性顆粒及人工合成微球等物理顆粒。
研究目的：通過流式分析研究顆粒性物質的特性，包括多種物理及生物學特征；通過利用不同熒光素標記不同組分將目的細胞與非目的細胞區分開來，從而獲得純度更高的目的細胞群并研究其物理及生物學特性。
技術特點：1.檢測速度快；2.準確性好；3. 精確度高；4. 細胞不被破壞；5.靈敏度高；6.可進行多參數檢測；7.不單限于表面抗原，可對發光度（如細胞體積）或熒光散射度（如DNA、RNA或蛋白含量、酶活性、特異抗原）來分離細胞。
01.流式細胞術的發展
流式細胞術是20世紀60年代后期開始發展起來的，流式細胞儀通過接受激光照射液流內細胞后的散射光信號和熒光信號反應細胞的物理化學特征，如細胞大小、顆粒度和抗原分子的表達情況等。主要應用于生命科學的基礎研究，尤其是免疫學、細胞生物學和分子生物學。80年代后期開始應用于臨床，輔助多種疾病的診斷，尤其是白血病的診斷和分型。隨后，利用流式分選干細胞過繼回輸用于疾病治療，如NK細胞回輸提高免疫力流式細胞儀分析軟件，CIK治療等。
隨著流式細胞術的發展，出現了多種型號的流式分析儀、分選儀，同時隨著配備的激光器的不斷升級，有些流式分析儀可進行多達10色以上的熒光分析。流式分析軟件的不斷優化，使得流式結果分析變得更加快速、便捷，并能簡單獲得多形式的流式分析示圖，極大地豐富了生物學檢測分析應用領域。這一集多個學科的智慧于一身，將計算機、電子工程、光學、流體力學、數學及有機化學等多學科巧妙地融合起來而誕生的流式細胞術在免疫學、發育生物學、細胞動力學、生理學、細胞生物學、分子生物學等生物學及醫學研究的各個領域得到了廣泛的應用，具有重大應用價值。
02.流式細胞術的應用
顆粒性物質的檢測：
細胞外表--細胞表面分子的檢測與分析等 ；
細胞內在--細胞內或細胞核內抗原檢測與分析及細胞核酸分析等 ；
細胞狀態--細胞凋亡與細胞增殖的檢測與分析、單細胞水平胞內磷酸化蛋白的檢測與分析等；
細胞及其細胞器功能--細胞毒、吞噬功能、胞內活性氧水平、細胞膜電位、細胞內鈣離子濃度的檢測與分析等 ；
細胞間相互作用--細胞融合的檢測，熒光共振能量轉移技術的應用等。
可溶性蛋白質分子的檢測：
多因子流式檢測技術--基于微球的免疫檢測技術，通過雙抗夾心ELISA與流式技術相結合來定量檢測可溶蛋白含量；
液相芯片流式熒光技術--基于聚苯乙烯微球直徑5.6μm，內部含有紅色和橙色兩種熒光染料，根據2種染料的比例不同可以將微球分成100多種，每種擁有一個編號，不同編號的微球被包被不同的探針分子，從而檢測樣品中的目的分子。可一次檢測一個樣本中的100多種目的分子；
CBA（ bead array）技術--利用人工合成的微球代替細胞，微球表面包被細胞因子抗體，利用熒光系統直接檢測分泌到細胞外的處于游離狀態的細胞因子。
03.常見的流式檢測與分析應用
1. 細胞表面分子、胞內抗原的檢測與分析
選擇與熒光素偶聯的抗體或使用一抗和與熒光素偶聯的二抗，通過抗原抗體結合原理，實現檢測細胞表面分子、胞內抗原表達量的目的，并可以作為一種抗體開發質控檢測手段。
2.細胞DNA倍體與周期檢測與分析
細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞，是細胞從2倍體到4倍體再分裂成2倍體的過程。
細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細胞在分裂結束后暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，執行一定生物學功能（G0期）。由于細胞周期各時期的DNA含量不同，通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量（2N），而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍體與四倍體之間。
碘化丙啶（ , PI）是一種核酸染料。可以與DNA結合，其熒光強度直接反映了細胞內DNA含量。因此，通過流式細胞儀PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區分為G1/G0，S和G2/M三期，從而可通過流式直方圖對各時相細胞百分率進行分析。
3.細胞凋亡的檢測與分析-/PI復染法
細胞凋亡（）是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。通過流式細胞術分析，可快速準確的得到細胞處于早期、晚期凋亡的細胞比例，反映藥物處理對細胞狀態的影響。
在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。 V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此 V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將 V進行熒光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的 V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（ , PI）不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將 V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。
Tips：/PI復染法僅針對細胞未轉染熒光質粒，如GFP、等及細胞本身無熒光干擾的體系。
4.胞內活性氧水平的檢測與分析-DCFH-DA 單染色法
2′,7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)為新一代ROS捕獲劑，可迅速通過細胞膜進入細胞，在細胞內酯酶作用下脫去二脂生成不發熒光的2′,7′-二氯雙氫熒光素(DCFH)，當細胞內存在H2O2，O2-等活性氧成分時，即被氧化成發熒光的2′,7′-二氯熒光素(DCF)，通過流式細胞儀測定細胞內DCF的熒光強度，即可對單個細胞為基礎的細胞內ROS進行原位實時檢測，從而根據熒光強度直接反映細胞內自由基的變化程度。
5.線粒體膜電位的檢測與分析-JC-1染色法
線粒體與細胞凋亡密切相關，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。其中線粒體跨膜電位（△ψ）的破壞，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件之一，它發生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。細胞凋亡時，線粒體外膜的通透性、選擇性增加使得細胞色素C等物質的釋放，會導致線粒體膜電位的下降。
JC-1(5,5’,6,6’--1,1’,3,3’-- ?)是一種陽離子脂質熒光染料，可作為檢測線粒體跨膜電位的指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態。低濃度時，以單體的形式存在；高濃度時，以多聚體形式存在，兩者的發射光譜不同。但均可在流式細胞儀綠色（Ex:488nm, Em:510/527nm）通道檢測出綠色熒光，JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態聚集胞內，正常健康線粒體的膜電位（△ψ）具有極性，JC-1依賴于△ψ的極性被迅速攝入線粒體內，并因濃度增高而在線粒體內形成多聚體，多聚體發射光為紅色熒光；可被流式細胞儀的紅色（(Ex:488nm, Em:580/590nm)）通道檢測到，而細胞發生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質內發綠色熒光。故而可以通過檢測綠色和紅色熒光來定性(細胞群的偏移）定量（細胞群的熒光強度）的檢測線粒體膜電位的變化。因JC-1濃度的變化，在單體和多聚體之間形成一個可逆的轉變過程。
6.細胞內鈣離子濃度的檢測與分析–Fluo-3/4染色法
Fluo-3/4是最適合應用于激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀檢測的鈣熒光探針之一。Fluo-3/4本身不能透過細胞質膜進人細胞內，但將其連接乙酰甲酯后形成Fluo-3/4/Am，后者可透過細胞質膜進人細胞內，再經非特異性酯酶脫去乙酰甲酯成為脂溶性的Fluo-3/4則可留在細胞內。
Fluo-3/4若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光的，但是當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光，最大激發波長為494nm，最大發射波長為516nm，敏感性高。當用494nm波長激發時，其熒光強度與游離鈣離子濃度成正比，據此敏感地測定細胞內鈣離子濃度。
04.流式服務實驗流程
1. 流式抗體選擇
根據不同實驗目的選擇合適的抗體及染料；
根據不同實驗目的選擇是否帶熒光素標記的抗體；
根據細胞抗原分子表達量和熒光素熒光強度選擇熒光染料；
根據流式細胞儀的類型及熒光素的熒光光譜選擇熒光抗體；
參照不同流式抗體公司提供的圖譜，選擇合適的熒光抗體。
2. 實驗操作流程
2.1全血樣本
Tips：所需試劑：熒光抗體、同型對照抗體、紅細胞裂解液、0.01M PBS。
2.2細胞膜表面標記流程——直接標記
Tips：所需試劑：熒光抗體、0.01M PBS、封閉液。
2.3細胞膜表面標記流程——間接標記
Tips：所需試劑：無熒光一抗、熒光二抗、同型對照抗體、0.01M PBS、封閉液。
2.4細胞膜內標記流程——直接標記
Tips：所需試劑：熒光抗體、同型對照抗體、0.01M PBS、固定液、穿膜劑。
2.5細胞膜內標記流程——間接標記
Tips：所需試劑：無熒光一抗、熒光二抗、同型對照抗體、0.01M PBS、固定液、穿膜劑。
3. 流式數據分析
3.1結果圖主要分為三類：直方圖、散點圖、等高線圖
流式直方圖：x軸表示一種通道值，y軸表示細胞數量，根據通道值與細胞個數之間的關系對細胞進行分群。
流式散點圖：表示兩個通道的信息，x軸表示一個通道的值，y軸表示另一個通道的值，圖中每一點代表一個細胞，該點所對應的橫坐標值就是該點所代表細胞的x軸通道的值，所對應的縱坐標值就是該點所代表細胞的y軸通道的值，它具有易于細胞分群、分類流式細胞儀分析軟件，以及確定比例關系等優點。
流式等高線圖：借助地理等高線圖表示細胞的密集程度，流式等高線圖的環線代表的是細胞密度相同的區域，所以，環線聚集越多的地方表示此區域細胞密度變化越快，細胞最稀疏的地方還是用散點表示，環線的中央區域代表細胞聚集的中心。在某些情況下，流式等高線圖比流式散點圖更能直觀地體現細胞的分群。
3.2 數據統計主要為：百分比（%）、熒光強度（mean、）、疊加擬合
百分比（%）：目的分子、細胞占所有細胞的百分比；
熒光強度（mean、）：mean是平均熒光強度，其缺點是：如果在當下視野里，細胞群體過大或過小，mean重復呈現性就會比較差。如果細胞群體都在視野里，可以用mean值。是熒光強度的中位數。100個細胞中50和51取個平均值。在標準的高斯分布情況下，=mean=mode，通常在流式中因為總會有異常值（超高或超低值）的存在，不是完美的高斯分布，建議使用，降低異常值對數據的影響。
疊加擬合：針對流式檢測數據利用分析軟件，如等進行不同處理組結果的疊加擬合分析，以方便更直觀地展示結果。
05.展望
流式細胞術以其速度快、精度高、準確性好等優點，在學術研究、臨床治療等方面具有廣泛應用前景，并獲得越來越多的學術研究者及醫藥工作者的青睞。流式細胞儀也隨科技的進步向小型化、微型化、多重熒光分析方向發展，分析靈敏度和準確性也明顯提高。隨著生物醫藥的發展，流式細胞術的應用幾乎涵蓋了整個生命科學和醫學領域，將來也必然在學術研究、臨床免疫學、臨床血液腫瘤學、臨床微生物學應用、細胞分選等方面得到更廣泛的應用。但限于流式細胞儀是高精密儀器并價格昂貴，要求使用者掌握和具備免疫學、分子生物學等多學科的知識和技術，而流式分選儀器的使用者更要求是經過培訓的專業技術人員，從而限制了流式細胞術在國內的應用，但隨著公共服務平臺的發展，這個問題必將會逐步改善。
06.普健的優勢
普健生物擁有經驗豐富的實驗操作人員及專業服務平臺，可提供流式細胞術相關的多種實驗操作及分析。還可提供包括細胞培養，給藥、誘導等處理及分子水平、蛋白水平等相關實驗的整套服務。
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