本發明屬于生物醫學檢測領域，涉及顯微角度圖像的機械形變，尤其是涉及了一種基于顯微定量角度圖像的細胞質心機械形變測量方法。
背景技術：
生物細胞的內部結構是實驗室研究、組織病理學和臨床診斷的主要研究對象，而光學顯微鏡用于觀察細胞內部結構，依賴于通過研究固定染色、細胞結構分段的實現對結構的變化進行檢查，揭示了疾病的起源和控制細胞功能的機制。然后，光學顯微方法有許多限制。基于組織樣本分析必須與先制備固定劑，染色劑和進行細胞切片，且只能分析單個細胞生命期內變化。定量相位成像技術克服了上述缺點，無須上述步驟就能展現活細胞的結構，具有高度靈敏，非侵入性的優點。此外，由于光學成像不會擾亂細胞的結構或功能，基于相位的技術成像許可對細胞的發育、形成和功能進行研究，通過對同一位置的性質進行結構觀測，可進一步測量細胞和亞細胞成分的結構和動力學的指標，并實現定量、納米尺度的測量。
通過干涉測量技術實現測量光的相位，并可利用光的其他方面來提供額外的能力和獨特的信息。而細胞的機械性能是細胞的重要指標，細胞活動可以通過細胞的剛性來揭示，與生理和行為、疾病狀態密切相關。
目前最常用的測量細胞的方式機械性能是原子力顯微鏡，通過懸臂來監測機械刺激，然而，該方法需要復雜的方案，破壞細胞培養環境，且需要可拉伸的基質用于顯微鏡前應，改變，可能會改變細胞骨架動力學。
技術實現要素：
針對于背景技術中存在的問題，本發明的目的在于提供了基于顯微定量角度圖像的細胞質心機械形變測量方法，能夠使用定量相位顯微圖像識別細胞的質心機械形變，并完成形變量的自動計算，提高了檢測效率，配合成像等外觀檢測方法，為細胞機械特性在線檢測奠定技術基礎。
本發明采用的技術方案是包括以下步驟：
1)細胞置于細胞培養液中，細胞培養液置于細胞容器中，驅動細胞培養液流動并在流動時采集單個細胞的離軸干涉圖像；
2)對離軸干涉圖像進行傅里葉變換，獲得傅里葉變換圖像；
3)去除傅里葉變換圖像的直流分量，并在傅里葉變換圖像中尋找交流分量幅值最大對應的頻率點位置，以該頻率點位置為中心，提取其附近的頻率區間；
4)對提取的頻率區間進行傅里葉反變換，在計算反變換后的幅角矩陣作為角度圖像；
5)使用離散余弦變換去卷繞法，對角度圖像進行去卷繞處理；
6)計算細胞剪切力；
7)根據角度圖像，計算細胞厚度；
8)根據細胞厚度和去卷繞后的角度圖像計算細胞質心漂移；
9)根據細胞剪切力計算形變牽引力，根據細胞質心漂移和形變牽引力計算細胞質心機械形變。
所述步驟6)具體為：
6-1)使用液體粘度計，測量液體的粘度，記為σ；
6-2)使用液體流速檢測儀，測量細胞容器的液體流速，記為
6-3)測量細胞容器的容器直徑，記為τ；
6-4)測量細胞容器的容器深度，記為d；
6-5)采用以下公式計算細胞剪切力：
所述步驟7)具體為：
7-1)使用折光儀，測量細胞培養液的折射率，記為n:；
7-2)采用以下公式計算細胞厚度：
dd(x,y)＝φ(x,y)λ/(2πn)
其中，λ為離軸干涉圖像采集時所使用的激光波長，φ(x,y)表示步驟5)獲得的去卷繞后的角度圖像中的像素點，x和y為圖像中像素對應的橫縱坐標。
圖像中每個像素對應有一個細胞厚度值。
所述步驟8)具體采用以下公式計算獲得細胞的質心漂移為：
其中坐標反算程序，φ(x,y)表示步驟5)獲得的去卷繞后的角度圖像中的像素點，i表示像素點的序號。
5、根據權利要求1所述的一種基于顯微定量角度圖像的細胞質心機械形變測量方法，其特征在于：所述步驟9)具體為：
9-1)在細胞培養液流動過程中，從細胞培養液開始流動的初始時刻到到達穩定流動狀態的時刻之間間隔采集多個時刻t的細胞離軸干涉圖像，進行步驟1)步驟-8)計算不同時刻t下的質心漂移r(t)；
9-2)采用以下公式計算細胞在細胞培養液中所受的形變牽引力為：f＝ζs，其中s為細胞在圖像中所占的面積；
9-3)然后對所有時刻t下的質心漂移r(t)使用以下公式表示的最小二乘法擬合：
其中，k和η分別為第一、第二待擬合參數；
9-4)最后用第一待擬合參數k和形變牽引力f計算細胞質心機械形變h為：
本發明適用于不同動物的不同種類細胞的質心機械形變的測量。
本發明采集的離軸干涉圖像可用于研究活細胞的結構和動態，與傳統方法比，本發明方法提高了測量的靈敏度和穩定性。
本發明具有的有益效果是：
本發明使用定量顯微角度圖像檢測細胞的機械性變，具有無損、快速、低成本的優點，大大提高了機械形變測量的效率和準確性。
本發明方法采用了光學相位參數表征手段坐標反算程序，并提出了對應的求解方法，對不同形狀、不同大小、不同厚度的細胞組織具有普適性，并能自動識別形變數量，較其他方法具有更好判別精度。
本發明采用進行了可被用于分析細胞膜彈性，并可在流室或微通道上的基質實現直接探測，檢測時無需對細胞進行化學處理，優于現有的其他快速檢測方案。
附圖說明
圖1是本發明方法的流程圖。
圖2是本發明實施例中紅細胞的原始干涉圖。
圖3是本發明實施例中干涉圖像進行二維傅里葉變換后的強度圖。
圖4是本發明實施例中傅里葉反變換后的角度圖像。
圖5是本發明實施例中去卷繞后的角度圖像。
圖6是本發發明實施例中力學曲線擬合計算的過程。
具體實施方式
以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
本發明采用的技術方案是包括以下步驟：
1)搭建離軸干涉顯微圖像系統，將人體的紅細胞置于細胞培養液中，細胞培養液置于細胞容器中，采集細胞的離軸干涉圖像，本系統采集圖像的波長為513納米，其原始干涉圖像如圖2所示；
2)對干涉圖像進行二維傅里葉變換，其變換后的強度圖像如圖3所示，圖中可見三處強度分量集中的點，其中中心位置為直流分量，二處對稱亮點為共軛交流分量；
3)去除傅里葉變換圖像的直流分量，并在圖像中尋找交流分量幅值最大處所在的頻率位置，圖3的中心位置為干涉圖像的直流分量，圖3中可見，在{112，106}坐標位置交流分量幅值最大處所在的頻率位置，可見圖像最大的頻率分量，并以該頻率位置為中心，提取x方向和y方向各100個頻率點的頻率范圍區間；
4)對區間頻率分量進行傅里葉反變換；則提取x方向和y方向各100個頻率點的頻率范圍區間作傅里葉反變換；
5)計算反變換后圖像每個像素的幅角，獲得角度圖象；圖4給出了反變換以后的角度圖像，圖中可見細胞的相位，同時也出現了周期性條紋，即所述的卷繞情況；
6)使用離散余弦變換去卷繞方法，對角度圖像進行去卷繞。具體實施的去卷繞采用《-，，1996》中所提到的方法處理，去卷繞后圖5所示；
7)計算細胞剪切力；
7-1)使用液體粘度計，計算液體的粘度，記為σ；本實施例當中的粘度為6mm2/s。
7-2)使用注射泵，控制液體流速，使用液體流速檢測儀，測量細胞容器的液體流速，記為
本實施例當中的液體流速為25ml/h。
7-3)測量細胞容器的直徑，記為τ；本實施例當中的容器直徑為5mm。
7-4)測量細胞容器的深度，記為d；本實施例當中的容器深度為5mm。
7-5)計算細胞剪切力：
8)根據角度圖像，計算細胞厚度；
8-1)使用折光儀，測量細胞培養液的折射率，記為n；本實施例當中的培養液體的折射率為1.42。
8-2)步驟6)所示的去卷繞后的角度圖像記為φ(x,y)，其中x和y為細胞圖像像素對應的坐標；
8-3)細胞厚度dd(x,y)＝φ(x,y)λ/(2πn)，其中λ為成像系統激光波長；
9)根據細胞剪切力和細胞，計算細胞質心漂移；
9-1)細胞的質心漂移為：
10)根據細胞質心漂移，計算細胞質心形變；
10-1)在本實施例中，以0-10秒為時間區間，每秒采集一次紅細胞離軸干涉圖像，使用步驟1)步驟-9)，計算不同時間截點下的質心漂移r(t)；
10-2)細胞在流體中所受的力為：f＝ζs，其中s為細胞在圖像中的面積；
10-3)認為10秒后質心形變到達穩定狀態，故在開始流動的起始時刻到到達穩定狀態時刻之間設置不同時間點采集，故可使用最小二乘法擬合如下方程
如圖6所示，；
10-4)計算機械形變為
本實施例的質心機械形變為0.7um。
對比現有報道的原子力顯微鏡法等，其檢測過程與理論曲線有較好的吻合，顯示了本發明方法的優勢。同時，由于相位顯微圖像不需要染色等預處理，且與細胞無接觸，結合本發明方法，使檢測的結果具有較好的穩定性，進一步避免了對細胞的污染，實現了無算探測細胞機械力的目的。
在本發明實施例中，本領域普通技術人員還可以理解，實現上述實施例方法中的全部或部分步驟是可以通過程序來指令相關的硬件來完成，所述的程序可以在存儲于一計算機可讀取存儲介質中，所述的存儲介質，包括rom/ram、磁盤、光盤等。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
技術總結
本發明公開了一種基于顯微定量角度圖像的細胞質心機械形變測量方法。采集細胞的離軸干涉圖像，進行傅里葉變換，去除直流分量，并在圖像中尋找交流分量幅值最大對應的頻率點位置，以該頻率點位置為中心，提取其附近的頻率區間進行傅里葉反變換；在計算反變換后的幅角矩陣作為角度圖像；對角度圖像進行去卷繞處理，計算細胞剪切力；根據角度圖像計算細胞厚度，再計算細胞質心漂移；根據細胞剪切力計算形變牽引力，根據細胞質心漂移和形變牽引力計算細胞質心機械形變。本發明方法實現了細胞質心形變的快速無損檢測，角度圖像對不同形態的細胞具有較強的適應性，提高了檢測效率，配合成像等外觀檢測方法，為細胞力學參數在線檢測奠定技術基礎。
技術研發人員：周揚;毛建衛;沙如意;蔡成崗;陳正偉;劉鐵兵;趙蕓;施秧;周武杰;陳芳妮;宋起文;陶紅衛;吳茗蔚;陳才;遲梁;王中鵬;邱薇薇;戴芹
受保護的技術使用者：浙江科技學院
技術研發日：2017.07.05
技術公布日：2017.10.20